Mohit Sharma
Rozwija się rewolucyjna technika określania trójwymiarowego kształtu białek. Cryo-EM to wersja mikroskopii elektronowej, która została wynaleziona w latach 30. Mikroskopy te wykorzystują wiązki elektronów zamiast światła do tworzenia obrazów próbek. Ponieważ długość fali elektronu jest znacznie krótsza niż długość fali światła, wiązki elektronów ujawniają znacznie mniejsze rzeczy. W ostatnich latach kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) przeszła najbardziej imponującą poprawę w porównaniu z innymi technikami stosowanymi w biologii strukturalnej, takimi jak krystalografia rentgenowska i NMR.
W połowie lat 70. naukowcy wpadli na pomysł zamrażania próbek, aby zachować naturalną strukturę próbek biologicznych i zmniejszyć uszkodzenia wiązki elektronów i tak narodziła się krio-EM. Technologia ewoluowała powoli, a kilka lat temu dokonała ogromnego kroku naprzód dzięki dramatycznym postępom w detektorach i oprogramowaniu. W 2017 roku trzech naukowców otrzymało Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za ich rolę w rozwoju krio-EM.
Mikroskopia krioelektronowa (CryoEM) zastąpiła krystalografię rentgenowską i NMR, stając się w ostatnich czasach popularnym i skutecznym narzędziem do określania struktury. Stała się niezbędna do charakteryzowania dużych zespołów makrocząsteczkowych, białek błonowych lub ograniczonych próbek, konformacyjnie niejednorodnych i opornych na krystalizację. Co więcej, jest to jedyne narzędzie zdolne do wyjaśniania struktur makrocząsteczek i zespołów biologicznych o wysokiej rozdzielczości in situ. Najnowocześniejszy kriogeniczny mikroskop elektronowy z funkcją pomiaru temperatury pomaga zachować szczegóły próbki biologicznej o wysokiej rozdzielczości. Struktury można określać w izolacji za pomocą analizy pojedynczych cząstek (SPA) lub rekonstrukcji helikalnej, dyfrakcji elektronów (ED) lub w środowisku komórkowym za pomocą tomografii krioelektronicznej (cryoET). Doprowadziło to do przełamania ograniczeń zarówno w zakresie wielkości makrocząsteczek/zespołów, których struktury można określić wraz z wizualizacją szczegółów atomowych w rozdzielczościach niespotykanych dla krioEM.
Obecnie cryo-EM generuje obrazy trójwymiarowe wirusów, cząsteczek i złożonych maszyn biologicznych wewnątrz komórki, takich jak rybosomy, w których syntetyzowane są białka o rozdzielczości zbliżonej do atomu. Zamrażając te małe rzeczy w ich naturalnym środowisku, naukowcy mogą zobaczyć, jak są zbudowane i co robią, znacznie bardziej szczegółowo niż kiedykolwiek wcześniej, łącząc tysiące obrazów, aby tworzyć filmy akcji, a nawet tworząc wirtualne „plasterki” w komórkach, jak a także miniaturowe skany CT. Tymczasem instrumenty krio-EM stały się łatwiejsze w użyciu i znacznie bardziej przystępne cenowo.
Podtechniki w mikroskopii krioelektronowej
1. Skaningowa kriomikroskopia elektronowa (krio-SEM).
2. Mikroskopia świetlna i elektronowa kriokorelacji (cryo-CLEM).
3. Tomografia krioelektroniczna (cryo-ET).
4. Transmisyjna kriomikroskopia elektronowa (krio-TEM).
Najnowsze zastosowania Cryo-EM
Nowy koronawirus, koronawirus zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) pojawił się jako globalna pandemia, która atakuje układ oddechowy z zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Jednak nadal nie ma ukierunkowanego środka terapeutycznego, a ze względu na rosnące przypadki infekcji i wzrost liczby zgonów; odkrycie możliwego leku jest potrzebą chwili. Ogólnie rzecz biorąc, badanie dotyczące odkrycia środka terapeutycznego dla SARS-CoV-2 koncentruje się w dużej mierze na badaniach przesiewowych na dużą skalę z odkrywaniem leków na podstawie fragmentów (FBDD). Dzięki niedawnemu postępowi w mikroskopii krioelektronowej (Cryo-EM) stało się jednym z najczęściej używanych narzędzi w biologii strukturalnej. Jest skuteczny w badaniu struktury wielu białek w wysokiej rozdzielczości, a także wywarł intensywny wpływ na odkrywanie leków, określanie reakcji wiązania i regulacji znanych leków, a także kierowanie projektowaniem i opracowywaniem nowych kandydatów na leki. Tutaj dokonujemy przeglądu zastosowania krio-EM w projektowaniu leków opartych na strukturze (SBDD) i badaniach przesiewowych in silico nowo nabytego FBDD w SARS-CoV-2. Te spostrzeżenia pomogą zapewnić lepsze zrozumienie w uzyskaniu skutecznego rozwiązania naprawczego dla tej pandemii.
Pole Cryo-EM zyskało na tyle popularność, że tylko kilka próbek, takich jak wirusy i rybosomy, jest czasami obrazowanych za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Cryo-EM dostarcza teraz obrazy w rozdzielczości atomowej zmian strukturalnych zachodzących w białku p97. Białko to jest ważnym celem dla rozwoju leków przeciwnowotworowych, ponieważ struktura i interakcje białka mają kluczowe znaczenie dla aktywności komórek rakowych. Dzięki zaawansowanym zdolnościom obrazowania Cryo-EM zaobserwowano rodzaj miejsca wiązania i kontaktu inhibitora p97. W badaniu uzyskano rozdzielczość 2,3 angströma, przy czym jednostka angströma odpowiada 0,1 nanometrowi. Cryo-EM ma potencjał do dalszej poprawy rozdzielczości dzięki postępom w technologii detektorów i przygotowywaniu próbek, które są obecnie w toku.
Instalacje Cryo-EM w Indiach
Obiekty krajowe wspierane przez Radę ds. Badań Naukowych i Inżynierii (SERB), instytucję należącą do Departamentu Nauki i Technologii (DST), pomogłyby w badaniu struktur i kompleksów makromolekularnych” oraz stworzeniu bazy wiedzy badawczej i umiejętności do badań krio. EM w Indiach jest liderem w dziedzinie biologii strukturalnej, enzymologii, odkrywania ligandów/leków. Utworzenie tych placówek we wszystkich kierunkach kraju – Indian Institute of Technology, Chennai; Indyjski Instytut Technologiczny w Bombaju; Indyjski Instytut Technologii, Kanpur; oraz Bose Institute w Kalkucie pomogłyby rozszerzyć badania biologii strukturalnej oparte na krio-EM w różnych zakątkach kraju. Ośrodki te zostały wyznaczone jako Krajowy Ośrodek Mikroskopii Krioelektronowej SERB i będą pracować w zidentyfikowanych obszarach ciągu. Będą dostępne dla wszystkich badaczy na całym świecie.
Ogólne znaczenie
Wcześniejsze techniki biologii strukturalnej obejmowały krystalografię rentgenowską i spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego. Obie metody mają ograniczone zastosowanie ze względu na potrzebę dużych rozmiarów próbek. Krystalografia rentgenowska wymaga również krystalizacji próbek, trudnego procesu, który zmienia środowisko na niefizjologiczne. Cryo-EM nie wymaga dużych rozmiarów próbek ani krystalizacji i dlatego nadaje się do wizualizacji struktur w rozdzielczości bliskiej atomowej. Metoda ma również tę zaletę, że nie utrwala chemicznie ani nie barwi próbki, co oznacza, że można ją badać w natywnym środowisku fizjologicznym. Ponadto, bez ograniczeń kryształów utrzymujących próbkę w pozycji statycznej, struktury można zamrażać w różnych konformacjach, aby umożliwić wydedukowanie mechanizmów biologicznych. Metoda krio-EM może być wykorzystana do określenia trójwymiarowej struktury bio-makrocząsteczek w warunkach zbliżonych do natywnych z bliską rozdzielczością atomową i może ujawnić konformacje dynamicznych kompleksów molekularnych. Cryo-EM to potężne narzędzie do badania biologicznych struktur makromolekularnych, w tym analizy ich dynamiki z wykorzystaniem zaawansowanych algorytmów przetwarzania obrazu. Metoda ta stała się jeszcze szerzej stosowana w obecnej analizie pojedynczych cząstek i tomografii elektronowej.
(Autor prowadzi badania z zakresu biologii strukturalnej w Polsce)
Joanna Bator jest autorką publikującą na portalu humanmag.pl, gdzie zajmuje się tematami z zakresu aktualności, polityki, biznesu, technologii, sportu, rozrywki i stylu życia. Koncentruje się na jasnym i rzetelnym przekazywaniu informacji, śledzeniu bieżących wydarzeń oraz prezentowaniu historii i tematów istotnych dla czytelników w przystępny i zrozumiały sposób.